Eso es lo que ha conseguido un equipo de investigadores liderados por el doctor Lukas Kapitein, de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Utrecht (Países Bajos). El desarrollo de esta técnica abre muchas posibilidades para la investigación básica, y quizás en un futuro también llegue a tener aplicaciones médicas. El descubrimiento ha sido publicado en la versión online de la revista Nature hace dos semanas.
Las proteínas motoras asociadas al citoesqueleto (quinesinas, dineínas y miosinas, en las células animales) son las responsables de posicionar a algunos orgánulos subcelulares -por ejemplo, a las mitocondrias, o a endosomas del aparato de Golgi- dentro de una célula. Algunas funciones de la célula requieren que los orgánulos estén "en su sitio" para que la célula pueda realizarlas correctamente, como la señalización intercelular (liberación de moléculas o recepción de señales enviadas por otras células), la polarización celular (un ejemplo de polarización es la estructura de las neuronas, con dendritas especializadas en recibir señales y axones especializados en transmitirlas) o el crecimiento y la migración celular (extensión de filopodios). Sin embargo, aunque se sabe que la posición es importante para la función de los orgánulas, esta conexión no se ha descrito todavía en detalle para muchos orgánulos, dado que hasta ahora no había ningún método que permitiese controlar de manera precisa el movimiento de estos en el citoplasma celular. El objetivo del equipo de Kapitein era el desarrollo de una técnica que permitiese precisamente eso.
En primer lugar, quisieron comprobar si eran capaces de activar mediante luz azul una unión selectiva de ciertos orgánulos a ciertas proteínas motoras que permaneciese aunque estas proteínas se pusieran en movimiento. Para ello, decidieron centrarse en utilizar luz azul para conseguir que peroxisomas se uniesen a quinesinas en células COS-7 de mono. Eligieron esta línea celular porque estos orgánulos suelen no moverse de la región perinuclear, y así podrían observar fácilmente los movimientos que ellos indujeran.
Marcaron los peroxisomas con una proteína quimérica PEX-LOV formada por el dominio PEX3 característico de peroxisomas, y un dominio fotosensible LOV, que encierra un péptido pequeño. Al iluminar las células con luz azul, el dominio LOV haría un cambio conformacional que expondría el péptido, el cual se uniría a un dominio PDZ modificado (ePDZb1) que habría sido fusionado junto con GFP al extremo de unión a la carga de la quinesina-3 (esquema del constructo en la Figura 1).
Al co-expresar los dos constructos e iluminar con luz azul, observaron que los peroxisomas se desplazaban hacia la periferia de la célula. Comprobaron que podían conseguir el efecto contrario, que los peroxisomas se concentraran en torno al núcleo, si utilizaban un constructo similar para unir los peroxisomas a dineínas (puede verse en el Vídeo 1). También observaron que este transporte de los peroxisomas no afectó a la posición de las mitocondrias u otros orgánulos.
Vídeo 1. Redistribución de peroxisomas acoplados a dineínas inducida por luz azul. Fuente: http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14128.html#videos (consultado el 25/01/2015)
Para asegurarse de que la técnica podría permitir situar un orgánulo en el lugar preciso con un grado de control espaciotemporal suficiente, los investigadores comprobaron si el reclutamiento de proteínas motoras era reversible (para poder interrumpirlo cuando el orgánulo esté en la posición requerida) y si podía estar restringido a una sola parte de la célula (para activar el transporte de parte de los orgánulos, sin necesidad de mover los peroxisomas de toda la célula). Para ello, en primer lugar, sometieron a las células a tres pulsos de luz azul, interrumpidos por 7 minutos sin irradiación de luz. El Vídeo 2 muestra el resultado: los peroxisomas se desplazaron hacia la periferia durante los pulsos de luz y permanecieron inmóviles durante los periodos sin luz. Este resultado indica que la unión de los peroxisomas a las quinesinas es reversible, y se interrumpe casi instantáneamente al apagar la luz.
Vídeo 2. La activación del transporte de peroxisomas asociado a microtúbulos mediante luz es reversible. Fuente: http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14128.html#videos (consultado el 25/01/2015)
En primer lugar, quisieron comprobar si eran capaces de activar mediante luz azul una unión selectiva de ciertos orgánulos a ciertas proteínas motoras que permaneciese aunque estas proteínas se pusieran en movimiento. Para ello, decidieron centrarse en utilizar luz azul para conseguir que peroxisomas se uniesen a quinesinas en células COS-7 de mono. Eligieron esta línea celular porque estos orgánulos suelen no moverse de la región perinuclear, y así podrían observar fácilmente los movimientos que ellos indujeran.
Marcaron los peroxisomas con una proteína quimérica PEX-LOV formada por el dominio PEX3 característico de peroxisomas, y un dominio fotosensible LOV, que encierra un péptido pequeño. Al iluminar las células con luz azul, el dominio LOV haría un cambio conformacional que expondría el péptido, el cual se uniría a un dominio PDZ modificado (ePDZb1) que habría sido fusionado junto con GFP al extremo de unión a la carga de la quinesina-3 (esquema del constructo en la Figura 1).
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| Figura 1. Esquema del constructo utilizado para conseguir que la irradiación con luz azul provoque el cambio conformacional que exponga el péptido unido a LOV, que se une con gran afinidad a ePDZb1. Esto hace que los peroxisomas se unan a las quinesinas y sean transportados hacia la periferia. |
Al co-expresar los dos constructos e iluminar con luz azul, observaron que los peroxisomas se desplazaban hacia la periferia de la célula. Comprobaron que podían conseguir el efecto contrario, que los peroxisomas se concentraran en torno al núcleo, si utilizaban un constructo similar para unir los peroxisomas a dineínas (puede verse en el Vídeo 1). También observaron que este transporte de los peroxisomas no afectó a la posición de las mitocondrias u otros orgánulos.
Vídeo 1. Redistribución de peroxisomas acoplados a dineínas inducida por luz azul. Fuente: http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14128.html#videos (consultado el 25/01/2015)
Para asegurarse de que la técnica podría permitir situar un orgánulo en el lugar preciso con un grado de control espaciotemporal suficiente, los investigadores comprobaron si el reclutamiento de proteínas motoras era reversible (para poder interrumpirlo cuando el orgánulo esté en la posición requerida) y si podía estar restringido a una sola parte de la célula (para activar el transporte de parte de los orgánulos, sin necesidad de mover los peroxisomas de toda la célula). Para ello, en primer lugar, sometieron a las células a tres pulsos de luz azul, interrumpidos por 7 minutos sin irradiación de luz. El Vídeo 2 muestra el resultado: los peroxisomas se desplazaron hacia la periferia durante los pulsos de luz y permanecieron inmóviles durante los periodos sin luz. Este resultado indica que la unión de los peroxisomas a las quinesinas es reversible, y se interrumpe casi instantáneamente al apagar la luz.
Vídeo 2. La activación del transporte de peroxisomas asociado a microtúbulos mediante luz es reversible. Fuente: http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14128.html#videos (consultado el 25/01/2015)
Para comprobar si el transporte de peroxisomas podía ser inducido sólo localmente y no en toda la célula a la vez, los investigadores iluminaron cuatro regiones diferentes en la misma célula. El Vídeo 3 muestra el resultado de este experimento: los peroxisomas de las regiones iluminadas se desplazaron rápidamente hasta alcanzar una zona no iluminada, a partir de entonces permanecieron quietos. Los peroxisomas de regiones no iluminadas no se movieron durante el experimento.
Vídeo 3. La activación del transporte de peroxisomas asociado a microtúbulos mediante luz puede ser local si se restringe la irradiación lumínica a ciertas áreas de la célula. Fuente: http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14128.html#videos (consultado el 25/01/2015)
Después de estas comprobaciones, los investigadores comprobaron si eran capaces de conseguir los mismos resultados utilizando el transporte de endosomas de reciclaje que presentasen la proteína RAB11. Observaron que podían estimular el transporte igual que con los peroxisomas (Vídeo 4).
Vídeo 4. Transporte de endosomas de reciclaje asociados a quinesinas inducido mediante luz azul. Fuente: http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14128.html#videos (consultado el 25/01/2015)
Los investigadores también comprobaron que, además de facilitarlo, podían inhibir el transporte de endosomas. Para ello, idearon un constructo diferente: un endosoma previamente unido a una quinesina, con lo cual estaría dirigiéndose hacia la periferia, y con un constructo PEX-LOV que al ser iluminado se uniría a una proteína ePDZ-GFP, unida a la región de carga de las cadenas de una miosina (Figura 2). Con este constructo comprobaron que en las células transfectadas el tráfico de endosomas hacia la membrana se veía interrumpido localmente al irradiar la célula con luz azul (Vídeo 5).
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| Figura 2. Esquema del constructo utilizado para conseguir que la irradiación con luz azul provoque que los endosomas transportados por quinesinas peroxisomas se unan a la miosina e interrumpan su transporte. |
Vídeo 5. Interrupción del transporte de endosomas de reciclaje mediante el reclutamiento de miosina-Vb inducida por la luz. Fuente: http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14128.html#videos (consultado el 25/01/2015)
Las células COS-7 son una línea celular similar a los fibroblastos que proviene del riñón del mono, inmortalizadas mediante la inoculación de un virus. Para comprobar si sus hallazgos eran transponibles a la biología de una célula más compleja y delicada sin afectar a su funcionamiento normal, los autores empezaron a experimentar con su técnica en cultivos primarios de neuronas hipocampales de rata.
Comprobaron que al inducir el acoplamiento de peroxisomas a cadenas de miosina-Vb irradiando células que coexpresaban PEX-LOV y la proteína de fusión miosina-Vb-GFP-ePDZb1 (descrita en la Figura 2), conseguían estimular el transporte de los peroxisomas hacia las espinas dendríticas (Vídeo 6).
Vídeo 6. El reclutamiento de miosina-Vb mediante luz dirige a los peroxisomas hacia las espinas dendríticas. Fuente: http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14128.html#videos (consultado el 25/01/2015)
Las vesículas RAB11 están relacionadas con el crecimiento axonal, pero hasta ahora no se había comprobado la función local que tenían en el cono de crecimiento. Utilizando los constructos descritos en la Figura 3, consiguieron grabar un efecto espectacular: la estimulación del transporte axonal mediado por quinesinas estimula el crecimiento axónico, mientras que la estimulación del transporte mediado por dineínas inhibe el crecimiento e incluso hace que el axón se retraiga. Estos dos resultados aparecen en el Vídeo 7.
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| Figura 3. Esquema de los constructos utilizados para conseguir que la irradiación con luz azul estimule el transporte de los endosomas de reciclaje hacia el extremo + de los microtúbulos, es decir, hacia la periferia celular (hacia el cono de crecimiento axónico en este caso), o bien para que esta irradiación estimule el transporte hacia el polo negativo, es decir, hacia el interior celular, lejos del cono de crecimiento axónico. en las células que tienen la proteína quimérica PDZ-GFP unida a quinesinas, se consigue el primer efecto y una estimulación del crecimiento axonal, y en las que contienen esta proteína unida a dineínas, el segundo efecto y una reducción e incluso retracción del cono de crecimientp axónico. |
Vídeo 7. La estimulación del transporte axonal mediado por quinesinas estimula el crecimiento axónico. La estimulación del transporte mediado por dineínas retrae el axón. Fuente: http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14128.html#videos (consultado el 25/01/2015)
Finalmente, los autores quisieron investigar el transporte de mitocondrias. Antes de este trabajo, se había propuesto que la proteína sintafilina inhibe el transporte mitocondrial mediante dos interacciones: en primer lugar, uniéndose directamente a las mitocondrias y a los microtúbulos, "anclando" a estos orgánulos, y en segundo lugar, mediante una inactivación indirecta con las quinesinas. Pero hasta este momento, no se había podido discernir si para que sea posible el transporte de las mitocondrias es necesario eliminar ambas interacciones, sólo una, o ninguna de ellas.
La hipótesis de los autores fue que el reclutamiento de más quinesinas sería suficiente para retomar el transporte mitocondrial. Para comprobarlo, activaron mediante luz azul el reclutamiento de quinesinas-GFP-ePDZb1 a mitocondrias axonales marcadas con TOM-LOV (todos los constructos mitocondriales están descritos en la figura 4). Comprobaron que el reclutamiento de más proteínas motoras era efectivamente suficiente para que el transporte de las mitocondrias volviera a ser posible (Vídeo 8). Por el contrario, la unión de sintafilina (figura 4) a mitocondrias marcadas con TOM-LOV mediante luz azul también se demostró suficiente para anclar mitocondrias en movimiento, independientemente de la dirección en la que se movieran (Vídeo 9). Estos resultados demuestran que el transporte o el anclaje de las mitocondrias no dependen de la activación de la maquinaria de transporte o de las proteínas de anclaje, sino de un equilibrio dinámico entre las dos fuerzas.
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| Figura 4. Esquema de los constructos para la unión de las mitocondrias a las quinesinas y para la unión de las mitocondrias a las sintafilinas, ambas mediadas por la irradiación de luz azul. Debajo, esquema del resultado de la inducción de ambas funciones |
Vídeo 8. Activación reversible del transporte anterógrado de mitocondrias axonales mediante el reclutamiento de quinesinas inducido por luz azul. Fuente: http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14128.html#videos (consultado el 25/01/2015)
Vídeo 9. Anclaje reversible de mitocondrias axonales mediante el reclutamiento de sintafilina inducido por luz azul. Fuente: http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature14128.html#videos (consultado el 25/01/2015)
Este artículo presenta una técnica que permite un grado de control sobre el transporte intracelular al que no nos habíamos aproximado hasta ahora, y probablemente será una herramienta valiosa en el estudio de la biología molecular de la célula, especialmente en las interacciones de los orgánulos con su entorno.
Escrito por Irene Sánchez Brualla
Referencias:
van Bergeijk P., Adrian M, Hoogenraad CC and Kapitein LC. Optogenetic control of organelle transport and positioning. Nature [Internet]. 2015 [cited 2015 Jan 24]. doi:10.1038/nature14128 [Epub ahead of print]
